發(fā)布時間：2022-09-16 13:45:00
2022年 8 月 5日，《PNAS》期刊在線發(fā)表了題為《三個不同的Atoh1增強子協(xié)同調(diào)控聲音受體毛細(xì)胞發(fā)育》的研究論文，該研究由中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）、神經(jīng)科學(xué)國家重點實驗室、上海腦科學(xué)與類腦研究中心劉志勇研究組與中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所、分子發(fā)育生物學(xué)國家重點實驗室陸發(fā)隆研究組合作完成。該研究解析了新生小鼠耳蝸毛細(xì)胞的全基因組開放染色質(zhì)圖譜，發(fā)現(xiàn)和驗證了兩個之前未知的Atoh1增強子。研究人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除單個或同時敲除多個Atoh1增強子，揭示了Atoh1的三個增強子以劑量依賴性協(xié)同調(diào)控毛細(xì)胞發(fā)育。該項研究結(jié)果為Atoh1表達的精準(zhǔn)表觀遺傳學(xué)調(diào)控機制提供了更深入的理論依據(jù)，并為耳蝸毛細(xì)胞再生提供了新的潛在靶點。
耳蝸毛細(xì)胞是聲音的感受器，轉(zhuǎn)錄因子Atoh1突變小鼠完全喪失毛細(xì)胞，相反，過表達Atoh1能夠額外產(chǎn)生更多的毛細(xì)胞。Atoh1的重要生物學(xué)功能使之成為毛細(xì)胞發(fā)育再生領(lǐng)域的一個重要的靶點。因此，深入理解Atoh1表達的調(diào)控機制有著重要的科學(xué)意義。Atoh1在毛細(xì)胞發(fā)育過程中高度動態(tài)變化，但其精準(zhǔn)調(diào)控機制仍知之甚少。過去20年來，Atoh1增強子1（Eh1）一直被認(rèn)為對Atoh1的表達至關(guān)重要。但這個假說一直并未得到體內(nèi)實驗的證實，而且毛細(xì)胞中是否還存在尚未發(fā)現(xiàn)的其他Atoh1增強子也未可知。
研究人員首先利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除Eh1，Eh1 -/- 小鼠耳蝸毛細(xì)胞發(fā)育完全正常，這表明Eh1對于毛細(xì)胞的發(fā)育不是必需的。這個結(jié)果和預(yù)期的完全相反，提示毛細(xì)胞還存在尚未發(fā)現(xiàn)的其他Atoh1增強子。隨后，研究人員流式分選獲得新生小鼠耳蝸毛細(xì)胞（圖1A），并利用染色質(zhì)開放性測序技術(shù)(ATAC-seq)，建立了毛細(xì)胞的全基因組染色質(zhì)開放圖譜,發(fā)現(xiàn)了兩個位于Atoh1遠(yuǎn)端的新增強子（Eh2和Eh3）。而且，Eh2和Eh3只在毛細(xì)胞中開放，而在對照組（小腦顆粒細(xì)胞前體細(xì)胞，同樣表達Atoh1）中處于關(guān)閉狀態(tài)，提示Eh2和Eh3是毛細(xì)胞特異的調(diào)控元件（圖1B）。隨后研究人員構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因小鼠，驗證了Eh2和Eh3是特異在毛細(xì)胞中活躍的增強子（圖1C）。為了進一步探究Eh2和Eh3在毛細(xì)胞發(fā)育中的功能，研究人員在小鼠中分別敲除Eh2和Eh3，毛細(xì)胞發(fā)育完全正?；蛘邇H有弱的發(fā)育異常。但是同時敲除Eh2和Eh3，毛細(xì)胞數(shù)量明顯減少；進一步發(fā)現(xiàn)，同時敲除三個Atoh1增強子使毛細(xì)胞數(shù)量進一步下降到最低點。正常的耳蝸毛細(xì)胞數(shù)量約2800個（圖1D），敲除Atoh1的三個增強子后，毛細(xì)胞數(shù)量急劇減少到約86個（圖1E），以上實驗結(jié)果表明Atoh1的三個增強子協(xié)同調(diào)控毛細(xì)胞的形成。
圖1 耳蝸毛細(xì)胞ATAC-seq，增強子驗證和功能分析。（A）耳蝸毛細(xì)胞流式分選和ATAC-seq示意圖。（B）Eh2和Eh3在毛細(xì)胞中保持開放，而在對照組中處于關(guān)閉狀態(tài)。（C）轉(zhuǎn)基因小鼠耳蝸染色分析發(fā)現(xiàn)Eh3特異驅(qū)動毛細(xì)胞中EGFP報告基因的表達。（D）正常野生型耳蝸毛細(xì)胞。（E）同時敲除Atoh1的三個增強子引起毛細(xì)胞數(shù)量急劇減少。
最后，研究人員利用CUT&RUN技術(shù)，揭示了Atoh1蛋白在耳蝸毛細(xì)胞中的全基因組結(jié)合位點，發(fā)現(xiàn)Atoh1可以直接結(jié)合到Eh1，Eh2和Eh3這三個增強子上，從而調(diào)控Atoh1自身的表達（圖2）。這個結(jié)果提供Atoh1的三個增強子被敲除后，Atoh1表達水平顯著下降，引起毛細(xì)胞數(shù)量急劇減少的分子機制。這個研究結(jié)果為在成年耳蝸支持細(xì)胞內(nèi)如何重新啟動Atoh1的表達提供了理論指導(dǎo)，有助于促進未來成年耳蝸毛細(xì)胞再生恢復(fù)的研究。
圖2 Atoh1和三個增強子的調(diào)控示意圖。在正常毛細(xì)胞中，Atoh1蛋白可以直接結(jié)合到三個增強子（Eh1，Eh2和Eh3）上，進而促進Atoh1自身的表達。三個增強子被同時敲除，失去了自主調(diào)控作用，引起Atoh1表達下降，毛細(xì)胞數(shù)量減少。
中科院腦智卓越中心劉志勇研究員和中科院遺傳發(fā)育所陸發(fā)隆研究員為該論文的共同通訊作者；腦智卓越中心博士研究生羅正南和遺傳發(fā)育所博士研究生杜毅為該論文共同第一作者，腦智卓越中心博士研究生李書亭，張迪，王廣琴，張赫博士和工作人員賀順姬對課題做出了重要貢獻，遺傳發(fā)育所舒慕婭博士也給予了重要幫助。該研究得到了中科院腦智卓越中心分子細(xì)胞技術(shù)平臺，光學(xué)成像平臺以及實驗動物平臺（實驗鼠房）的大力支持。該研究得到科技部，中科院，基金委和上海市的支持。
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