

發(fā)布時間:2023-06-25 15:02:00
2023年6月23日,《Genome Biology》期刊發(fā)表了題為《CATI: an efficient gene integration method for rodent and primate embryos by MMEJ suppression》的研究論文,該研究由中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心(神經(jīng)科學(xué)研究所)劉真研究組和非人靈長類研究平臺孫強團隊合作完成。研究人員通過使用RNA基因編輯工具CasRX下調(diào)參與MMEJ修復(fù)的關(guān)鍵基因DNA聚合酶θ(polq),在小鼠胚胎中顯著提高了線性化雙鏈DNA以及單鏈短DNA片段(ssODN)外源模板的基因敲入效率,該基因敲入方法被命名為CATI(CasRX-assisted targeted integration)(圖1)。此外,利用CATI的方法也能提升食蟹猴胚胎基因敲入的效率。

圖1 CATI策略的原理圖
對哺乳動物基因組進行精準(zhǔn)基因整合是一項低效,但具有重要價值的研究手段。近年來,CRISPR/Cas9基因編輯工具的出現(xiàn),為制備精準(zhǔn)基因編輯的動物模型提供了高效手段。CRISPR/Cas9系統(tǒng)利用Cas9核酸酶與單鏈導(dǎo)向RNA(sgRNA),通過有效誘導(dǎo)基因組中特定位點發(fā)生DNA雙鏈斷裂(DNA double strand break, DSB),從而進行基因組編輯。DSB主要由非同源末端連接(NHEJ)、微同源末端連接(MMEJ)和同源重組(HDR)三種機制來修復(fù)。相比NHEJ和MMEJ修復(fù)途徑中不可預(yù)測的堿基插入或者刪除,HDR通路利用與DSB位點周圍區(qū)域具有同源序列的模板(內(nèi)源性或外源性DNA)為供體模板,以精確重組的方式修復(fù)DNA,可以實現(xiàn)基因組DNA的精準(zhǔn)基因插入、刪除以及單個核苷酸的替換。因此,基于HDR的基因編輯方法為開發(fā)安全、高精度的人類疾病基因治療技術(shù)提供了基礎(chǔ)。然而,在哺乳動物細胞基因組中,HDR修復(fù)效率非常低,這限制了精準(zhǔn)編輯在哺乳動物細胞中的應(yīng)用。近年來,很多研究人員致力于從抑制NHEJ、激活HDR通路、控制細胞周期等方面提高HDR效率(Ma et al., Cell Res, 2017; Zhao et al., Nucleic Acids Res, 2022; Quadros et al. Genome Biol., 2017)。
該研究針對21個基因位點設(shè)計了88條sgRNA,對1500枚小鼠胚胎進行基因編輯,通過Sanger測序鑒定sgRNA的編輯效率以及靶標(biāo)位點的DNA修復(fù)模式。分析發(fā)現(xiàn)sgRNA編輯的效率越高,MMEJ修復(fù)模式所占的比例越高。注射后胚胎的RNA-seq及Q-PCR數(shù)據(jù)表明,外源DNA模板的存在會誘導(dǎo)MMEJ修復(fù)的核心蛋白polq的基因表達上升。通過結(jié)合Cas9介導(dǎo)的基因敲入和CasRX介導(dǎo)的Polq基因敲低的CATI策略,研究人員成功在小鼠十多個位點上實現(xiàn)了基因敲入效率的提升,其中3個位點的胚胎通過移植獲得了基因敲入小鼠,這些小鼠敲入的基因型可以被傳遞到下一代,證明了CATI在動物模型構(gòu)建中的應(yīng)用潛力。
該研究還以腦智卓越中心楊輝研究組提出的線性化供體模板為基礎(chǔ)(Yao et al., Dev Cell, 2018),在小鼠胚胎水平上,整體比較分析了此前已經(jīng)報導(dǎo)的10種具有代表性的基因敲入效率提升方法。發(fā)現(xiàn)二細胞時期胚胎注射策略(Gu et al., Nat Biotechnol, 2018)可以被穩(wěn)定重復(fù),在與CATI策略結(jié)合后可以進一步提升敲入效率,在Actb位點的敲入效率最高達到了91.3%。此外,CATI在非人靈長類胚胎中同樣可以提升效率,在測試的CDX2位點上,敲入效率從37.9%提升到64.9%,在H3.3B位點上從50.8%提升到74.5%。
最后,研究人員對CATI策略進行了全面的安全性評估。GOTI實驗表明,CATI技術(shù)并不會引入更多的突變和基于Cas9的脫靶;全基因組進行序列分析同樣發(fā)現(xiàn),CATI不會引入更多的外源DNA模板的隨機整合;對編輯位點附近序列進行三代測序發(fā)現(xiàn),CATI可以有效減少大片段的缺失。CATI策略為疾病動物模型的開發(fā)以及基因疾病的臨床治療提供了新的選擇。
腦智卓越中心陳紅玉博士、博士研究生劉星辰和碩士研究生李蘭心為該論文共同第一作者。劉真研究員、孫強研究員、陸宗陽博士為該論文的共同通訊作者。該研究得到科技部、中國科學(xué)院、上海市和基金委的資助。感謝腦智卓越中心光學(xué)成像平臺、分子細胞技術(shù)平臺和實驗動物平臺對本工作提供的有力支持。
來源:劉真研究組、非人靈長類研究平臺
文字:劉真、陳紅玉
圖片:劉真、陳紅玉

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