發(fā)布時間：2022-05-20
從小嬰兒咿呀學(xué)語、蹣跚學(xué)步到嬉笑怒罵、經(jīng)歷生活敲打的酸甜苦辣，無一不需要大腦的參與。大腦作為情緒、思想、行動等的載體，是宇宙中最迷人也最復(fù)雜的研究對象。如果說“想象”存在?？康奈恢茫敲创竽X毫無疑問便是起源。然而，記憶是如何形成并存儲的，意識是什么，情緒是如何產(chǎn)生的——這些日常生活中我們習(xí)以為常的事件的發(fā)生背后都隱含著神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的重要科學(xué)問題。
從17世紀(jì)胡克通過顯微鏡第一次觀察到植物細(xì)胞到19世紀(jì)施萊登、施旺建立起細(xì)胞學(xué)說，人們逐漸認(rèn)識到：細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。然而，由于缺乏使神經(jīng)系統(tǒng)“顯形”的有效染色方法，人們對神經(jīng)系統(tǒng)的基本組成知之甚少。當(dāng)時科學(xué)界普遍認(rèn)可約瑟夫·格拉赫（Joseph von Gerlach）基于他的氯化金染色法提出的網(wǎng)狀學(xué)說，即像人體的血管網(wǎng)絡(luò)一樣，神經(jīng)組織是由神經(jīng)細(xì)胞融合而成的連續(xù)網(wǎng)絡(luò)。1873年，卡米洛·高爾基（Camillo Golgi）發(fā)明重鉻酸銀染色法（后稱高爾基染色法），可以使少量神經(jīng)元（1-5%）染色，從而使完整的神經(jīng)元形態(tài)暴露于世人眼中——然而高爾基對此并不懷疑網(wǎng)狀學(xué)說的正確性。1887年，圣地亞哥·拉蒙·卡哈爾（Santiago Ramón y Cajal）第一次接觸到高爾基染色的神經(jīng)組織樣本，并大受震撼——此后他基于改良的高爾基染色方法對大量腦組織切片進(jìn)行細(xì)致的觀察，向網(wǎng)狀學(xué)說發(fā)起挑戰(zhàn)，指出神經(jīng)細(xì)胞是相互獨(dú)立的單位。
在卡哈爾一系列發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，1891年，瓦爾岱耶（Wilhelm von Waldyer）正式提出“神經(jīng)元”的概念，并建立起神經(jīng)元理論。1906年，為表彰高爾基和卡哈爾在神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的解析中做出的杰出貢獻(xiàn)，他們二人共同獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。即使是在頒獎禮上，二人仍針鋒相對，為自己的學(xué)說進(jìn)行辯論。而直到電子顯微鏡發(fā)明，這一學(xué)術(shù)爭論才真正一錘定音——神經(jīng)元學(xué)說成為現(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)發(fā)展的基本理論。卡哈爾由此被認(rèn)為是現(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)之父。
卡米洛·高爾基與圣地亞哥·拉蒙·卡哈爾（左）和卡哈爾繪制的神經(jīng)元（右）
如今我們已經(jīng)知道，正是大腦中小小的神經(jīng)元通過突起相互聯(lián)系組成了復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，處理來自體內(nèi)外的紛繁復(fù)雜的信息，嚴(yán)密監(jiān)控、指導(dǎo)著機(jī)體的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。據(jù)估計，哺乳動物的大腦有數(shù)以百萬計的細(xì)胞，人腦擁有860億個神經(jīng)元。DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)人之一、諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎獲得者Crick和Jones在給 Nature 的評論中寫道：“我無法忍受我們沒有繪制出人類大腦的連接圖。沒有它，很難有希望能了解我們的大腦是如何工作的?！薄覀円肜斫獯竽X的工作原理，繞不開對于大腦結(jié)構(gòu)的精細(xì)解析。而神經(jīng)元作為研究大腦功能的基本單位，對于其結(jié)構(gòu)的認(rèn)識無疑有助于理解大腦的信息組織架構(gòu)——正像是唯有明白了電視機(jī)內(nèi)部每個元件如何連接組織，我們才能掌握電視機(jī)如何播放圖像、聲音，如何接受外界的指令。小鼠作為生命科學(xué)領(lǐng)域的明星模式動物，解析它的全腦神經(jīng)元結(jié)構(gòu)特征自然便成為了科學(xué)家們首先關(guān)注的科學(xué)問題。因此，正如同卡哈爾一樣，我們面臨的問題是選擇一項合適的技術(shù)實(shí)現(xiàn)對神經(jīng)元的可視化。
神經(jīng)元結(jié)構(gòu)圖
一個典型的神經(jīng)元由胞體、樹突、軸突構(gòu)成。其中，樹突粗而密集，位于胞體附近，接收其他神經(jīng)元的信息輸入。軸突則又長又細(xì)，可以延伸很遠(yuǎn)，軸突的末端可以形成突觸前末梢，與另一個神經(jīng)元的樹突或者胞體形成突觸連接，通過釋放突觸遞質(zhì)參與神經(jīng)元之間的信息傳遞。神經(jīng)元胞體通常為十幾到幾十微米不等，軸突長度卻可以達(dá)到厘米級別，而其直徑卻僅為0.2-0.5微米。也就是說，為了能看清神經(jīng)元的軸突走向，我們至少應(yīng)該選擇達(dá)到微米級的成像手段。目前，電鏡作為成像分辨率最高的技術(shù)手段，可以實(shí)現(xiàn)納米級別的成像，也已經(jīng)應(yīng)用到小動物如線蟲、果蠅的神經(jīng)元連接圖譜的研究中——但是僅僅小鼠的腦體積就相當(dāng)于線蟲腦體積的一千萬倍，更不用說腦容量更大的靈長類了?？紤]到小鼠全腦范圍成像所需成本、時間及產(chǎn)生的龐大的數(shù)據(jù)量——電鏡成像很明顯不適用。為了滿足在全腦尺度上解析神經(jīng)元連接圖譜，科學(xué)家們將視線投向光學(xué)成像。
線蟲、果蠅、小鼠腦容量比較
2010年，華中科技大學(xué)駱清銘教授團(tuán)隊利用自主研發(fā)的顯微光學(xué)切片斷層成像（micro-optical sectioning tomography, MOST）技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)小鼠全腦的高分辨率圖譜繪制。他們利用改良的高爾基染色方法對鼠腦進(jìn)行染色，并利用Spurr樹脂對鼠腦進(jìn)行包被。為了繞過光學(xué)成像的成像深度限制，他們創(chuàng)造性地提出了“邊切片邊成像”的策略。在成像時，金剛石刀片將固定好的小鼠腦子切成厚度為1微米、寬450微米的條狀組織薄片，隨后由光學(xué)顯微鏡對切好的薄片進(jìn)行成像。歷經(jīng)242小時，完成對小鼠全腦的成像，通過后期的數(shù)據(jù)處理，可以將切片圖像拼接最終重構(gòu)形成三維立體的小鼠全腦圖譜。
MOST技術(shù)成像原理示意圖（左）及小鼠腦成像結(jié)果圖展示（右）
雖然MOST技術(shù)實(shí)現(xiàn)了小鼠全腦的神經(jīng)元成像，但是在實(shí)際研究中科學(xué)家們更傾向于利用熒光蛋白標(biāo)記某些神經(jīng)元而不是利用染色的方法對全腦神經(jīng)元進(jìn)行染色。因此發(fā)展可以實(shí)現(xiàn)熒光成像的MOST技術(shù)即fMOST（fluorescence micro-optical sectioning tomography）則成為他們下一階段的目標(biāo)。
與染色劑所需的明場成像不同，熒光蛋白由于對溫度、pH更加敏感，稍有不慎就可能導(dǎo)致信號淬滅，對于成像的要求也就更高了。為此，他們改進(jìn)了鼠腦在成像前的處理和包被方法，最大限度地減少熒光信號的丟失，同時保證組織薄片具備合適的硬度，避免組織過薄發(fā)生變形影響成像效果。為了能準(zhǔn)確獲得神經(jīng)元胞體及突起的在大腦中的定位信息，他們也利用大腦中的標(biāo)志性位置結(jié)合MRI和小鼠標(biāo)準(zhǔn)腦圖譜進(jìn)行了相應(yīng)的計算和轉(zhuǎn)換，從而完成對神經(jīng)元形態(tài)的標(biāo)注——就像我們身處于一個陌生的城市，根據(jù)手機(jī)地圖可以輕松定位到當(dāng)前的位置——二維的標(biāo)準(zhǔn)腦圖譜就相當(dāng)于手機(jī)地圖，我們結(jié)合自己看到的地標(biāo)性建筑實(shí)現(xiàn)對手機(jī)地圖和所處實(shí)景的對應(yīng)。
2015年，科學(xué)家們應(yīng)用線臺掃描共聚焦（stage-scanning line confocal microscopy）進(jìn)一步提高了成像速度。2016年，他們基于一種稱為全腦定位系統(tǒng)（Brain-wide Positioning System，BPS）的全自動顯微成像方法，通過在成像時同時染出細(xì)胞結(jié)構(gòu)標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)在單細(xì)胞分辨率水平的精準(zhǔn)定位細(xì)胞結(jié)構(gòu)。2021年，駱清銘團(tuán)隊提出一種高清晰度、高通量的光學(xué)層析顯微成像新方法——線照明調(diào)制光學(xué)層析成像（Line illumination microscopy, LiMo），在快速高分辨率光學(xué)成像時能顯著提高背景抑制能力極大地提高了成像質(zhì)量，提升了數(shù)據(jù)存儲與分析的效率。
fMOST成像過程展示
據(jù)報道，僅為攻克腦樣本制備的難題，駱清銘教授團(tuán)隊耗費(fèi)了三年時間。技術(shù)的研發(fā)涉及到生物、光學(xué)、機(jī)械、計算機(jī)數(shù)據(jù)處理等多學(xué)科領(lǐng)域的合作交叉。經(jīng)過十幾年的研發(fā)與優(yōu)化，fMOST技術(shù)具備高分辨率、高通量、高清晰度的優(yōu)點(diǎn)，自動成像快速高效且準(zhǔn)確地獲取神經(jīng)元的形態(tài)信息，為后續(xù)重構(gòu)、分析全腦范圍神經(jīng)元形態(tài)打下堅實(shí)的基礎(chǔ)，已經(jīng)成為研究解析全腦介觀神經(jīng)元連接圖譜的一大利器，在全世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用。
和人類社會相似類似，每個人都是一個獨(dú)立的個體，但又由于一些相似的特征而被分成各個群體。神經(jīng)元也會擁有一系列的特征標(biāo)簽，基因表達(dá)，神經(jīng)元形態(tài)，投射信息和電生理特性等。為了更清晰地認(rèn)知神經(jīng)元世界的運(yùn)作規(guī)則，更高分辨率的細(xì)胞分群信息在神經(jīng)生物學(xué)內(nèi)變得尤為重要。通過更高分辨率的手段獲得的分群信息幫助我們捕獲那些已知投射和功能的集團(tuán)，更重要的是揭示出潛在的新細(xì)胞群體，更系統(tǒng)全面地揭示大腦的工作原理。fMOST及其配套的分析手段發(fā)展為我們提供了繪制大腦聯(lián)接網(wǎng)絡(luò)的可能性，與其他技術(shù)手段結(jié)合構(gòu)建神經(jīng)元類型標(biāo)準(zhǔn)框架，幫助揭示大腦功能。目前建立全腦神經(jīng)元聯(lián)接圖譜庫是世界各國打造全球腦科學(xué)中心的重要基礎(chǔ)?，F(xiàn)詳細(xì)為大家分享fMOST技術(shù)是如何助力于腦科學(xué)研究的。
fMOST與多技術(shù)協(xié)作構(gòu)建單神經(jīng)元級別的全腦聯(lián)接圖譜
fMOST的一個主要用處在于構(gòu)建全腦聯(lián)接圖譜，從而與多技術(shù)協(xié)作揭示高分辨率的神經(jīng)元分群，幫助我們更好地闡釋大腦發(fā)揮功能的單元。中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心嚴(yán)軍研究組、徐寧龍研究組與華中科技大學(xué)蘇州腦空間信息研究院、武漢光電國家研究中心龔輝團(tuán)隊合作在Nature Neuroscience 期刊以封面文章的形式在線發(fā)表了題為Single-neuron projectome of mouse prefrontal cortex（小鼠前額葉單細(xì)胞投射譜）的研究論文，其中很好地展示了fMOST技術(shù)的這一應(yīng)用。
前額葉皮層在決策、工作記憶、注意力等高級認(rèn)知功能中扮演重要角色，其結(jié)構(gòu)和功能的異常會導(dǎo)致多種腦疾病。其投射范圍很廣，幾乎覆蓋大部分腦區(qū)，包括皮層、紋狀體、丘腦、中腦和后腦等。這篇文章使用自主開發(fā)的Fast Neurite Tracer (FNT)光學(xué)成像大數(shù)據(jù)神經(jīng)元追蹤及分析軟件，系統(tǒng)性地重構(gòu)了小鼠前額葉皮層6357個單神經(jīng)元全腦投射圖譜，建立了國際上最大的小鼠全腦介觀神經(jīng)聯(lián)接圖譜數(shù)據(jù)庫（圖 A）；揭示了小鼠前額葉皮層內(nèi)64種神經(jīng)元投射亞型的空間分布規(guī)律，發(fā)現(xiàn)不同群之間存在不同的投射特征（圖B）；闡明了前額葉內(nèi)部模塊化的連接網(wǎng)絡(luò)和等級結(jié)構(gòu)（圖C）。在構(gòu)建全腦聯(lián)接網(wǎng)絡(luò)的同時，研究人員也致力于與多技術(shù)協(xié)作建立一個能夠整合多種分子空間遺傳信息與多方面表型性質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化神經(jīng)元分型框架。該文章整合了神經(jīng)環(huán)路與轉(zhuǎn)錄組細(xì)胞類型的聯(lián)系。通過逆向示蹤和熒光原位雜交技術(shù)獲得神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄組亞型與投射亞型的對應(yīng)關(guān)系（圖D）。以往的研究利用群體示蹤技術(shù)來研究前額葉皮層神經(jīng)元的全腦投射模式，并不能很好地解析前額葉腦聯(lián)接網(wǎng)絡(luò)的工作模式和等級結(jié)構(gòu)。通過fMOST 技術(shù)實(shí)現(xiàn)的單細(xì)胞水平成像幫助揭示了前額葉皮層內(nèi)部連接和外部投射的規(guī)律，并提出了前額葉皮層可能的工作模型。
（A）重構(gòu)mPFC神經(jīng)元在腦內(nèi)空間分布。（B）mPFC全腦軸突投射分布（右），幾種具有不同投射選擇性的神經(jīng)元亞型（左）。(C)利用FNT 算法對單神經(jīng)元投射圖譜進(jìn)行聚類分析的結(jié)果（左），兩種差異性高亞型（SCm-projecting / PCG-projecting) 的三維重構(gòu)結(jié)果（右）。（D前額葉內(nèi)部連接網(wǎng)絡(luò)的模塊化和等級結(jié)構(gòu)。（E）前額葉投射亞型與基因亞型的關(guān)系（CT皮層丘腦神經(jīng)元在PL-ORB腦區(qū)）。
fMOST描繪精細(xì)神經(jīng)元形態(tài)
單細(xì)胞水平的神經(jīng)元精細(xì)結(jié)構(gòu)解析能直觀的揭示神經(jīng)元特性。fMOST可以在極高的分辨率下重構(gòu)神經(jīng)元形態(tài)，觀察神經(jīng)元的精細(xì)結(jié)構(gòu)。武漢光電國家研究中心駱清銘教授率領(lǐng)的MOST團(tuán)隊與美國冷泉港實(shí)驗室黃佐實(shí)教授（Prof. Z. Josh Huang）課題組合作在Cell Reports發(fā)表的題了為Genetic Single Neuron Anatomy Reveals Fine Granularity of Cortical Axo-Axonic Cells（遺傳單神經(jīng)元解剖學(xué)揭示皮層軸突-軸突細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu)）的文章，開發(fā)了fMOST在這一方面的具體應(yīng)用。
在該文章中，研究者們設(shè)計了一種基于fMOST成像的，適用于遺傳特異標(biāo)記的單細(xì)胞解剖學(xué)結(jié)構(gòu)精準(zhǔn)研究平臺（genetic Single Neuron Anatomy platform, gSNA）。通過解決單細(xì)胞遺傳標(biāo)記、全腦精準(zhǔn)成像、神經(jīng)元重構(gòu)和定量分析這四個方面的難點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了對AAC（Axo-Axonic Cells）細(xì)胞全腦單細(xì)胞尺度的解析。對全腦多個腦區(qū)的AAC細(xì)胞進(jìn)行系統(tǒng)性的單神經(jīng)元重建，發(fā)現(xiàn)AAC細(xì)胞的胞體位置、樹突和軸突纖維的空間分布模式不是隨機(jī)的，而是與大腦皮層分層相關(guān)。通過綜合大量重構(gòu)細(xì)胞數(shù)據(jù)，利用合理定量手段及聚類分析對細(xì)胞分型，發(fā)現(xiàn)AAC細(xì)胞存在多種亞型。該研究全面的利用定量和定性手段解析了AAC細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分型，更新了人們對AAC細(xì)胞的認(rèn)知，有助于對AAC細(xì)胞的進(jìn)一步理解和功能揭示。
技術(shù)路線及皮層內(nèi)AAC亞群分類結(jié)果
工欲善其事，必先利其器。生命科學(xué)的每一次發(fā)展，都以重大技術(shù)的進(jìn)步為前提。fMOST技術(shù)為腦科學(xué)的發(fā)展做出了重大貢獻(xiàn)，極大推進(jìn)了對大腦結(jié)構(gòu)和功能的理解，從“看”得見，到“看”得清、“看”得懂。與現(xiàn)在使用的fMOST成像技術(shù)相比，電鏡可以很好地重構(gòu)納米級分辨率的細(xì)胞微小結(jié)構(gòu)，提供接近真實(shí)的細(xì)胞間聯(lián)接的狀態(tài)，完整的納米級/突觸分辨率的聯(lián)接圖譜提供了對環(huán)路有貢獻(xiàn)的所有信息。這些知識可用于揭示正常和病變狀態(tài)下環(huán)路特征并構(gòu)建環(huán)路模型、識別功能相關(guān)的關(guān)鍵神經(jīng)元，以及基于遠(yuǎn)程連接和超微結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞類型。對秀麗隱桿線蟲和果蠅等模式生物的研究已經(jīng)證明全腦聯(lián)接譜在支持神經(jīng)環(huán)路深入研究方面的潛力。但是目前電鏡技術(shù)只能重構(gòu)~1 mm3大小的結(jié)構(gòu)，而小鼠大腦總體級約500 mm3，人的大腦則有小鼠的1000倍大。同時也對后續(xù)的數(shù)據(jù)分割、處理、存儲，運(yùn)算等方面的技術(shù)水平要求大幅提高。但毫無疑問，獲得納米級的神經(jīng)元聯(lián)接譜數(shù)據(jù)將在神經(jīng)領(lǐng)域引起顛覆性的改變，也是后續(xù)腦圖譜繪制的發(fā)展目標(biāo)之一。圖譜計劃的完善將奠定神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)。覆蓋全腦范圍的聯(lián)接譜以及精確的胞間聯(lián)接結(jié)構(gòu)繪制將徹底改變腦功能研究方式，從專注于假設(shè)驅(qū)動的研究到旨在闡明功能環(huán)路的基本規(guī)則的大型團(tuán)隊協(xié)作項目。這些進(jìn)展將為發(fā)現(xiàn)腦疾病相關(guān)的新環(huán)路機(jī)制奠定基礎(chǔ)，幫助解決腦疾病難題。
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作者：中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心 杜赟 王秋淼
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