發(fā)布時間：2017-05-03
2017年5月2日，《Journal of Cell Biology》期刊在線發(fā)表了題為《視網(wǎng)膜成體干細胞胚胎起源雙潛能細胞》的研究論文，該研究由中科院神經(jīng)科學研究所、腦科學與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心何杰研究組完成。該研究采用基于彩虹魚克隆分析，在單細胞水平上揭示了視網(wǎng)膜干細胞在視網(wǎng)膜睫狀邊緣區(qū)的準確定位；同時在邊緣區(qū)中發(fā)現(xiàn)一類目前尚未報道的靜息態(tài)細胞。此外，此研究采用原位細胞譜系追蹤，闡述了視網(wǎng)膜干細胞胚胎發(fā)育的精確細胞譜系，從而揭示視網(wǎng)膜干細胞起源于視泡 (optic vesicle)中間層上皮細胞中的一群雙潛能細胞。此項工作發(fā)現(xiàn)了視網(wǎng)膜干細胞發(fā)育的細胞譜系基礎(chǔ)，為進一步的視網(wǎng)膜干細胞發(fā)育的分子機制，最終實現(xiàn)視網(wǎng)膜干細胞微環(huán)境的體外重建提供重要的實驗依據(jù)。
在低等脊椎動物中，視網(wǎng)膜干細胞位于視網(wǎng)膜睫狀邊緣區(qū)中。在低等脊椎動物一生中，例如斑馬魚，視網(wǎng)膜能夠不斷增大。整個終生的視網(wǎng)膜生長就是通過視網(wǎng)膜干細胞的增殖和分化而實現(xiàn)的。在進化的過程中，更高等的脊椎動物，視網(wǎng)膜睫狀邊緣區(qū)細胞產(chǎn)生各種視網(wǎng)膜神經(jīng)元的能力會更越弱。但是越來越多的證據(jù)表明，在哺乳動物中，視網(wǎng)膜睫狀邊緣區(qū)細胞仍然具備產(chǎn)生新的神經(jīng)元的潛能，只是在體內(nèi)的環(huán)境中，這些潛能被沉默了。其原因目前尚不清晰，這也是神經(jīng)發(fā)育和再生領(lǐng)域一個重大命題。因此，更好地了解低等動物視網(wǎng)膜干細胞的微環(huán)境及其胚胎起源，將更有助于我們了解高等脊椎動物，如哺乳動物視網(wǎng)膜干細胞沉默的原因，為尋找激活這些干細胞的方法提供重要實驗依據(jù)。
在以往以斑馬魚為模式動物研究視網(wǎng)膜發(fā)育的過程中，發(fā)現(xiàn)眼柄通過外翻發(fā)育成具有中間上皮細胞和外側(cè)上皮細胞的視泡結(jié)構(gòu)，視泡中的中間上皮細胞通過遷移進入外側(cè)上皮細胞，逐漸發(fā)育為視杯結(jié)構(gòu)，而視網(wǎng)膜的干細胞就是來源于這群視泡中間上皮細胞。但是對于視網(wǎng)膜干細胞在視網(wǎng)膜中的具體定位以及胚胎視網(wǎng)膜前體細胞發(fā)育為視網(wǎng)膜干細胞的精確細胞譜系模式尚不清楚。
研究團隊以斑馬魚為模式動物，采用基于彩虹魚的克隆分析，將視網(wǎng)膜干細胞精確定位于視網(wǎng)膜睫狀邊緣區(qū)最外周第二層或第三層細胞。相對于視網(wǎng)膜睫狀邊緣區(qū)中其他視網(wǎng)膜前體細胞，視網(wǎng)膜干細胞的細胞周期比較長。此外，研究團隊還發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜睫狀邊緣區(qū)最外周第一層細胞是一類完全處于靜息狀態(tài)的新細胞類型。RNA原位雜交實驗表明，它們既不表達視網(wǎng)膜干細胞的分子標記，也不表達或者僅微弱表達視網(wǎng)膜色素細胞相關(guān)的分子標記。關(guān)于這類新的細胞對于視網(wǎng)膜干細胞的維持的作用還需要進一步的研究。
在準確定位視網(wǎng)膜干細胞的基礎(chǔ)上，研究人員進一步尋找視網(wǎng)膜干細胞的胚胎起源。Kaede是一種光轉(zhuǎn)化蛋白，在405nm激光照射下，能夠由綠色變?yōu)榧t色。將核定位光轉(zhuǎn)化蛋白nls-kaede的mRNA注射到野生型斑馬魚的胚胎中。在視網(wǎng)膜發(fā)育的視泡階段，對表達Kaede蛋白的視泡中間上皮細胞進行單細胞光轉(zhuǎn)化，通過分析由單個上皮細胞衍生的克隆，研究人員發(fā)現(xiàn)：視網(wǎng)膜干細胞只能由視泡中間上皮細胞中一群雙潛能細胞產(chǎn)生；這群雙潛能細胞產(chǎn)生視網(wǎng)膜干細胞的同時產(chǎn)生視網(wǎng)膜色素細胞，是一群細胞周期比較短的細胞。RNA原位雜交實驗表明，這群雙潛能細胞既表達視網(wǎng)膜干細胞的分子標記，也表達視網(wǎng)膜色素細胞的標記。而視網(wǎng)膜視泡中間上皮細胞中的其他細胞則只能產(chǎn)生視網(wǎng)膜色素細胞或者視網(wǎng)膜前體細胞。
此工作在單細胞水平上揭示了視網(wǎng)膜睫狀邊緣區(qū)微環(huán)境中的細胞類型組成及其特征，為深入探究視網(wǎng)膜干細胞微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)維持提供了實驗基礎(chǔ)。此外，雙潛能細胞的發(fā)現(xiàn)為深入研究視網(wǎng)膜干細胞胚胎發(fā)育的分子機制提供了細胞譜系基礎(chǔ)，為最終理解視網(wǎng)膜干細胞的產(chǎn)生和維持機制提供可能。
此項工作由助理研究員湯霞和實習生高嘉男在何杰研究員的指導下完成；課題組的賈新玲協(xié)助完成了重要的RNA原位雜交實驗；研究期間項目還得到了健康所潘巍峻研究團隊的協(xié)助。
在斑馬魚出生后18小時到26小時這段期間，視泡中間上皮細胞層的快速分裂的雙潛能細胞（BP，藍色）遷移進入外側(cè)上皮細胞層，在這個過程中雙潛能細胞增殖產(chǎn)生一個視網(wǎng)膜色素上皮細胞的前體細胞（PP， 黑色） 和一個視網(wǎng)膜干細胞的前體細胞（SP，紅色）。隨后視網(wǎng)膜干細胞的前體細胞（SP，紅色）表現(xiàn)出較長的細胞周期，并通過細胞分裂產(chǎn)生三種類型的細胞譜系模式：一種為非対稱分裂產(chǎn)生一個視網(wǎng)膜干細胞（S，紅色） 和一個CMZ尖端靜息態(tài)細胞 （D；黑色/紅色；占RSC產(chǎn)生的細胞譜系的60%）；第二種為非対稱分裂產(chǎn)生一個視網(wǎng)膜干細胞RSC（S，紅色）和一個視網(wǎng)膜前體細胞（RP，紅色；占RSC產(chǎn)生的細胞譜系的38%）；第三種為對稱分裂產(chǎn)生兩個視網(wǎng)膜干細胞（S，紅色；占RSC產(chǎn)生的細胞譜系的2%）。與此同時，視網(wǎng)膜色素上皮細胞前體細胞（PP，黑色）通過增殖分裂產(chǎn)生兩種類型的細胞譜系：一種細胞譜系包括兩個視網(wǎng)膜色素細胞（P；黑色，64%）；另外一種細胞譜系包括一個視網(wǎng)膜色素細胞（P，黑色）和一個CMZ尖端靜息態(tài)細胞（D，黑色/紅色；36 %）。CMZ尖端靜息態(tài)細胞（D，黑色/紅色）既可以由視網(wǎng)膜色素上皮細胞前體細胞（PP, 黑色）產(chǎn)生，也可以由視網(wǎng)膜干細胞前體細胞（SP，紅色）產(chǎn)生。
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