開發(fā)圖譜繪制新技術(shù)
嚴軍團隊自主開發(fā)了名為Gapr的新一代大規(guī)模單神經(jīng)元重構(gòu)系統(tǒng)。Gapr創(chuàng)新地整合了基于深度學習的全自動重構(gòu)、多用戶同時參與協(xié)同校對、高效響應用戶需求的圖像數(shù)據(jù)處理等多種功能，大幅提升神經(jīng)元重構(gòu)的效率。Gapr的開發(fā)對推動全腦介觀神經(jīng)聯(lián)結(jié)圖譜的繪制具有重要意義。相關研究成果發(fā)表在Nature Methods雜志。
圖 神經(jīng)元重構(gòu)系統(tǒng)新架構(gòu)Gapr
a，Gapr的五個模塊，包含圖像數(shù)據(jù)處理的Convert模塊，自動重構(gòu)的Trace模塊，協(xié)同重構(gòu)服務器端的Gather模塊及人工校對的Proofread和Fix模塊；b，響應用戶需求的圖像數(shù)據(jù)處理；c，Gapr的神經(jīng)元模型，與SWC文件格式兼容。
2、單細胞標記和成像方法開發(fā)
在聯(lián)合實驗室資助下，研究人員通過多維同步三維飛掃熒光顯微成像技術(shù)（VISoR）結(jié)合組織透明化與半自動追蹤（SMART）流程，實現(xiàn)獼猴全腦微米精度的高通量成像，完成獼猴運動皮層神經(jīng)元單細胞全腦投射軸突的三維重構(gòu)。相關研究成果發(fā)表在Neuroscience Bulletin雜志。
圖 獼猴神經(jīng)元稀疏標記和全腦成像
介觀神經(jīng)聯(lián)接圖譜的功能研究
1、基于神經(jīng)聯(lián)接圖譜定義的多特征神經(jīng)元分子標記工具
大腦神經(jīng)元具有復雜多樣的細胞類型。細胞類型的精確定義對解析大腦神經(jīng)環(huán)路連接與功能具有關鍵作用，最終將幫助我們更好地理解神經(jīng)系統(tǒng)的工作原理。全腦投射譜分析揭示了單個神經(jīng)元往往具有多個目標投射腦區(qū)。這些多目標投射的特征給特定神經(jīng)元類型的功能提供了結(jié)構(gòu)基礎，但目前還欠缺能夠基于多種投射特征精確標記、記錄和操控特定細胞類型的分子工具。徐春團隊運用intein內(nèi)含肽介導的蛋白剪接技術(shù)，在神經(jīng)細胞內(nèi)實現(xiàn)控制子（tTA）蛋白水平組裝。此組裝具多條件交叉特性，可驅(qū)動效應基因表達，用于多特征神經(jīng)元特異性標記與功能研究。該研究開發(fā)出標記、記錄、操控多特征神經(jīng)元的新型分子工具，揭示腹側(cè)海馬神經(jīng)元投射與情緒編碼關系，為解析復雜神經(jīng)環(huán)路提供精細且廣泛適用的工具集。 相關研究成果發(fā)表在Nature Communications雜志。利用這些技術(shù)，徐春團隊解析了海馬長軸環(huán)路對記短期維持的神經(jīng)機制。由此，介觀聯(lián)接的結(jié)構(gòu)與功能連接進入了一個新的階段，即基于單細胞全腦投射譜定義環(huán)路和多特征神經(jīng)元的新階段。
（A）IBIST工具的質(zhì)粒設計和工作原理。（B）利用IBIST工具標記接收背側(cè)海馬輸入的腹側(cè)海馬CA1的SOM+中間神經(jīng)元，表達光遺傳蛋白NpHR。（C）黃光操控SOM中間神經(jīng)元的電活動。（D）利用IBIST工具在投射到4個下游腦區(qū)的海馬興奮性神經(jīng)元（CaMKIIα標記）當中表達鈣指示蛋白GCaMP6s。（E）海馬神經(jīng)元的熒光信號和鈣反應。
2、獼猴前額葉雙光子顯微成像技術(shù)和序列記功能研究
雙光子顯微成像技術(shù)是非常前沿的投射譜功能檢驗的實驗方法，可以追蹤同一群神經(jīng)元跨實驗周期和跨天的神經(jīng)活動。雖然該技術(shù)在小鼠的功能研究當中已經(jīng)非常廣泛應用，但在非人靈長類的應用當中還有非常多的挑戰(zhàn)。王立平團隊在清醒獼猴進行工作記憶依賴的認知任務時，利用雙光子顯微成像技術(shù)對獼猴前額葉神經(jīng)細胞活動進行了大規(guī)模記錄和連續(xù)追蹤，發(fā)現(xiàn)了序列工作記憶的獼猴大腦當中表征的幾何結(jié)構(gòu)。該研究發(fā)表在Science期刊。
由于雙光子顯微成像需要在頭部固定動物當中進行，然而，導航和場景相關的實驗研究需要動物的行走互動。徐春團隊設計了高性能的VR裝置，并申請獲批相關專利。在此基礎上，匈牙利合作方Balázs Rózsa團隊開發(fā)了沉浸式立體視覺的VR設備，并且通過立體視覺更好地模擬真實世界。相關成果發(fā)表在Nature Methods期刊。動物在VR當中導航時，Balázs Rózsa團隊與合作者一起發(fā)現(xiàn)了局部環(huán)路放大空間信息的海馬環(huán)路機制。相關成果發(fā)表在Nature期刊。
Balázs Rózsa團隊還開發(fā)了對鋅離子成像的探針，并和雙光子顯微成像適配。相關成果發(fā)表在Chemistry: A European Journal 雜志。研究團隊利用聲光顯微成像技術(shù)研究行為動物大腦皮層稀疏神經(jīng)網(wǎng)絡及廣泛樹突分支結(jié)構(gòu)的功能，結(jié)合聽覺辨別與檢測任務，對稀疏中間神經(jīng)元群體的樹突和胞體進行成像。研究揭示了來自多個腦區(qū)、此前尚未被揭示的亞細胞層面機制及網(wǎng)絡作用機制。相關成果發(fā)表在Biophotonics Congress: Optics in the Life Sciences 專著當中。
圖 在頭部固定動物上產(chǎn)生立體視覺的VR設備
研發(fā)新型腦疾病治療方法
聯(lián)合實驗室還致力于研究新型的腦疾病治療方法。我們重點探索四個方向：一是基因編輯技術(shù)，二是干細胞治療技術(shù)，第三是小分子藥物的篩選，第四是構(gòu)建非人靈長類模型的方法。
CRISPR-Cas13是一類由RNA介導的靶向RNA的基因編輯技術(shù)。Cas13蛋白本身普遍存在的旁切活性已成為其走向臨床應用的最大障礙，如何降低或消除Cas13蛋白的旁切活性顯得尤為必要，開發(fā)更特異的高保真Cas13蛋白對基于RNA編輯的基因治療策略研發(fā)及后續(xù)的臨床轉(zhuǎn)化具有重要意義。楊輝團隊開發(fā)出特異性更高、安全性更好的高保真版Cas13系統(tǒng)。通過對大量內(nèi)源基因位點進行RNA敲低的實驗，hfCas13d表現(xiàn)出與野生型Cas13d同樣的高活性。結(jié)合體外切割實驗、全轉(zhuǎn)錄組分析、穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系、轉(zhuǎn)基因小鼠、在體靶向RNA敲降等技術(shù)，對hfCas13d進行了系統(tǒng)性的脫靶效應驗證及安全評估。綜合而言，此項工作開發(fā)出了具有高效編輯活性但極低旁切活性的高保真Cas13d蛋白變體，這一新工具顯示出更高特異性，而且在基因治療方面具有更好的安全性。該成果發(fā)表在Nature Biotechnology雜志。
圖 高保真Cas13蛋白的工程化設計、篩選及脫靶效應驗證
干細胞治療技術(shù)在基礎和應用研究當中都有廣闊應用前景。小鼠胚胎干細胞注射到囊胚并形成嵌合體的技術(shù)是構(gòu)建遺傳修飾小鼠模型的關鍵技術(shù)。然而非人靈長類胚胎干細胞嵌合體研究一直進展緩慢。?劉真團隊以封面文章的形式在Cell期刊發(fā)表研究論文，并申請了相關專利，包括國際專利。該研究在國際上首次成功構(gòu)建了高比例胚胎干細胞貢獻的出生存活嵌合體猴，并證實了猴胚胎干細胞可以高效的貢獻到胚外胎盤組織和生殖細胞。這對于理解靈長類胚胎干細胞全能性具有重要意義，為遺傳修飾模型猴的構(gòu)建奠定了技術(shù)基礎。
人多能干細胞，包括人胚胎干細胞和人誘導多能干細胞，為細胞治療提供了大量的可再生的細胞資源。然而，目前的干細胞分化技術(shù)還有不少局限：體外分化得到的移植用供體細胞存在高度異質(zhì)性；供體細胞移植后，腦內(nèi)移植物中的目標神經(jīng)元的比例通常較低；移植物的細胞組成未知。陳躍軍團隊解析了中腦多巴胺能神經(jīng)分化的單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，發(fā)現(xiàn)了中腦多巴胺能神經(jīng)祖細胞的特異性表面蛋白分子，并且應用它們來獲得高純度的目的供體細胞，實現(xiàn)穩(wěn)定且可預測的帕金森病細胞治療結(jié)果。研究成果在The Journal of Clinical Investigation期刊發(fā)表，進一步推進了神經(jīng)退行性腦疾病的干細胞治療方法。
3、小分子藥物篩選
張洪鈞團隊利用生物節(jié)律紊亂獼猴模型，與中國科學院藥物所合作，篩選多種小分子化合物，發(fā)現(xiàn)小分子化合物TPN和ISX可以明顯改善節(jié)律紊亂獼猴的睡眠障礙和新環(huán)境探索行為。目前，該研究成果正在整理投稿過程中。相關成果已經(jīng)申請了專利。
非人靈長類模型對腦疾病機理解析和治療方法開發(fā)都非常重要，但非人靈長類模型的構(gòu)建的效率與能量仍然需要不要不斷提高。孫強、熊志奇、劉真團隊利用外源 FSH 和睪酮，使得15個月齡的實驗猴產(chǎn)生正?；盍?。此技術(shù)大幅縮短食蟹猴繁殖傳代時間，解決精巢異種移植相關問題。科研人員借此加速繁育MECP2 轉(zhuǎn)基因猴和PRRT2基因敲除猴，成功獲得相應F1代和MECP2轉(zhuǎn)基因猴F2代。該技術(shù)促進了非人靈長類遺傳修飾動物模型的應用，相關研究成果發(fā)表在National Science Review雜志。孫強、劉真團隊進一步構(gòu)建了恒河猴-食蟹猴雜交猴，建立了適用于雜交猴的數(shù)據(jù)分析流程，證明了雜交猴在分析等位特異的表達（allele-specific expression，又稱ASE基因）上的優(yōu)勢，并通過雜交猴策略得到了腦組織中的ASE基因圖譜。相關研究發(fā)表在The Innovation雜志。該研究表明恒河猴和食蟹猴雜交后代可被用作研究印記基因的工具，可與多組人類疾病相關的數(shù)據(jù)庫進行聯(lián)合分析，揭示了特定基因與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在關聯(lián)性。
